Blog


Ultrasonic Homogenizer dalam Penelitian Virus

23 Maret 2020 Ultrasonic Homogenizer

Lisis dan ekstraksi ultrasonik adalah metode yang andal dan telah lama dikembangkan untuk disruption sel dan pelepasan virus, protein virus, DNA, dan RNA.


Ultrasonic dalam Penelitian Virus

Ekstraksi dari jaringan pada organ virus merupakan langkah persiapan sampel yang penting sebelum menganalisis virus (mis., Asam nukleat, kapsomer, glikoprotein). Homogenisasi ultrasonik adalah metode yang cepat, mudah dan dapat direproduksi untuk preparasi sampel seperti homogenisasi jaringan, lisis, disruption sel, ekstraksi bahan intraseluler serta fragmentasi DNA dan RNA. Persiapan sampel ultrasonik adalah langkah umum sebelum reaksi berantai polimer (PCR).


Jual Ultrasonic Homogenizer, Ultrasonic Homogenizer, Ultrasonic Homogenizer Hielscher, Ultrasonic Homogenizer Sonicator, Ultrasonic Homogenizer Disruptor, Ultrasonic Extractor Homogenizer, Handheld Ultrasonic Homogenizer, Ultrasonic Milk Homogenizer, Ultrasonic Tissue Homogenizer, Jual Hielscher UP50H, Jual Hielscher 100H, Jual Hielscher UP200St, Jual Hielscher UP200Ht, Jual Hielscher UP400St, Distributor Alat Laboratorium, Jual Alat Laboratorium


Aplikasi Virus dalam Ultrasonic Homogenizer

  • Lisis sel untuk mengekstraksi virus dari jaringan dan kultur sel
  • Dispersi cluster virus
  • Ultrasonic DNA - RNA Shearing / fragmentasi pada jaringan virus


Ultrasonic DNA Shearing

  • Selama pemotongan DNA dan RNA, molekul DNA dipecah menjadi potongan- potongan kecil. Fragmentasi DNA / RNA adalah salah satu langkah persiapan sampel penting yang diperlukan untuk langkah langkah penelitian DNA/RNA berikutnya
  • Ultrasonic DNA shearing menggunakan kekuatan kavitasi akustik untuk memecah DNA atau RNA menjadi potongan-potongan 100 - 5kb bp.
  • Dalam hal ini pemotongan DNA/RNA menggunakan ultrasonic homogenizer merupakah metode pemotongan DNA/RNA secara fisik
  • Ultrasonic DNA shearing memungkinkan untuk fragmentasi DNA yang tepat dan adaptasi dengan panjang DNA yang diinginkan.


Berikut ini beberapa contoh aplikasi untuk ekstraski DNA-RNA Shearing/ fragmentasi

Pengujian Immunopresipitasi Chromatin

Secara singkat, sel-sel disepuh dalam piringan berdiameter 60mm (400.000 per piringan) dan ditransfeksi dengan RhoA siRNA (seperti dijelaskan); setelah 72 jam, mereka diinkubasi dengan formaldehida (konsentrasi akhir, 1%) selama 10 menit pada suhu 37 ° C untuk menghubungkan protein ke DNA. Reaksi ikatan silang dipadamkan dengan penambahan volume sepersepuluh 1,25 mol / L glisin, memberikan konsentrasi akhir 125 mmol / L. Sel dicuci dua kali dengan PBS dingin, disuspensikan kembali dalam buffer uji radioimunopresipitasi [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, deoksikolat 0,5%, SDS 0,1%, EDL 5 mmol / L, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0) )] mengandung 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag / mL aprotinin, dan 1 Ag / mL pepstatin A, dan disimpan di es selama 30 menit. Kemudian, lisat sel disonikasi di atas es dengan Hielscher UP200Ssonicator ultrasound (3 x 40 s, amplitudo 40%, siklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) sampai kromatin yang saling terhubung dicukur untuk menghasilkan fragmen DNA antara 200 dan 1.000 bp. Sepersepuluh dari seluruh lisat digunakan untuk mengukur jumlah DNA yang ada dalam sampel yang berbeda dan dianggap sebagai "DNA input total". Supernatan diinkubasi dengan DNA sperma salmon / protein agarose-50% bubur untuk mengurangi latar belakang yang tidak spesifik. Imunopresipitasi kemudian dilakukan semalaman pada suhu 4 ° C dengan 5 Ag anti-NF-nB p65 (Bagian Atas) atau tanpa antibodi (kontrol negatif). Supernatan ini dilengkapi dengan 5 mol / L NaCl dan dipanaskan semalaman pada suhu 65 ° C untuk mengembalikan ikatan protein-DNA. Immunokompleks lebih lanjut diobati dengan proteinase K-bebas DNase dan RNase, dan DNA dimurnikan dengan ekstraksi fenol / kloroform dan presipitasi etanol. PCR dilakukan dengan primer spesifik sesuai dengan urutan dalam wilayah promotor gen iNOS manusia (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)


Penelitian EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)

Untuk studi ekspresi, strain rekombinan L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Jerman) dengan gen untuk EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosom ssu terintegrasi, diolah dalam berbagai media seperti yang dijelaskan sebelumnya dan tambahannya ditambah dengan 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Jerman). Selama budidaya, 1 ml sampel diambil, disentrifugasi (2000 × g, 20 ° C, 10 menit) dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9%. Pelet diresuspensi dalam buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dan hancur oleh proses sonifikasi dengan prosesor ultrasonik UP400S (aplikasi energi ∼ 400 Ws). Puing-puing sel dihilangkan dengan sentrifugasi (6000 × g, 4 ° C, 5 menit) dan dianalisis dengan natrium dodesil sulfat - elektroforesis gel poliakrilamida (SDS-PAGE) di bawah kondisi reduksi sesuai dengan metode Laemmli (1970) dengan 12,5% gel poliakralamida . Uji EGFP diperiksa. (Fritsche et al. 2007)


Chromatin immunoprecipitation

Uji imunopresipitasi kromatin dilakukan menggunakan ChIP-ITTM Express (Motif Aktif, Carlsbad, CA, AS) sesuai dengan instruksi pabrik dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, podosit manusia yang berdiferensiasi terkait silang dengan formaldehida 1% selama 10 menit pada suhu kamar. Sel-sel dicuci dengan PBS dingin dan reaksi fiksasi dihentikan dengan menambahkan 0,125 M glisin selama 5 menit pada suhu kamar. Sel dicuci lagi dengan PBS sedingin es dan dikikis dari dish. Sel dipelet dengan sentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam buffer lisis.

Setelah sentrifugasi, inti pellet disuspensi kembali dalam buffer geser, diinkubasi di atas es selama 30 menit dan kromatin dipotong dengan sonikasi, mis. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Jerman) dengan daya 25%, mode 5 pulse masing-masing 20 detik di atas es menjadi fragmen sekitar 200-600 bp. Kromatin yang difragmentasi kemudian disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan. Untuk immunoprecipitations, 60 μl kromatin diinkubasi dengan 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) atau NF-κB p50 (Abcam) antibodi atau dengan kelinci IgG (Laboratorium Zymed, San Francisco Selatan, CA, AS), sebagai kontrol negatif, semalaman pada suhu 4 ° C dengan rotasi lembut. Imunokompleks yang terikat dengan manik-manik magnetik dikumpulkan menggunakan penyangga magnetik, dicuci secara luas, dan ikatan silang protein / DNA dibalik dan DNA dielusi untuk analisis PCR real-time. (Ristola et al. 2009)


Preparasi EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli) DNA Untuk Chip Array Analysis

Pengaturan lisat sel dan ekstraksi DNA Pelet bakteri yang dimasukkan sampai konsentrasi akhir yang diinginkan diolah dengan ultrasonic disruption UP100H (Hielscher GmbH, Jerman) yang dilengkapi dengan mikrotip MS1 (berdiameter 1mm). Frekuensi operasi adalah 30 kHz dan daya output efektif adalah 100 W. Selama operasi, sampel didinginkan dalam bak air es, dicampur dan disentrifugasi. Sampel digunakan untuk studi aliran cytometry, sedangkan untuk penanganan selanjutnya, sampel dipanaskan (95 ° C, 5 menit). Lisat sel kasar diproses dengan campuran fenol: kloroform: isoamyl alkohol (25: 24: 1). Volume yang sama dari campuran ini ditambahkan ke sampel lisat, larutan itu vortexed dengan kuat selama 15 detik dan disentrifugasi pada 15.000 x g selama 2 menit pada suhu kamar (RT) sekitar 22 ° C. Fase berair atas yang mengandung DNA genom dipisahkan dengan hati-hati dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf steril baru. Selanjutnya, sampel disonikasi menjadi fragmen DNA. Langkah sonication diwujudkan dalam kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas. Untuk mengevaluasi efek fragmentasi pada DNA genomik, sampel dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.

Sampel disonikasi sebelumnya selama 2,5 menit menjadi sasaran langkah ekstraksi setelah dipanaskan dan disentrifugasi. DNA yang diekstraksi dua kali dengan campuran fenol: kloroform: isoamyl alkohol, dan setelah itu dilakukan sonikasi kedua selama 0 - 15 menit. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menentukan distribusi ukuran DNA yang mengalami fragmentasi ultrasonik pasca ekstraksi. DNA yang sangat terfragmentasi terbukti dari adanya noda DNA daripada pita dengan berat molekul tinggi yang dihilangkan dari sampel yang disonikasi selama 2,5 menit atau lebih. Sonikasi yang lebih lama secara bertahap mengurangi panjang fragmen menjadi sekitar 150 - 600 bp, dan sonikasi selama 15 menit semakin mendegradasi fragmen-fragmen ini, seperti yang dapat dilihat sebagian besar oleh bagian atas noda. Dengan demikian, ukuran fragmen DNA rata-rata secara bertahap menurun dengan waktu ultrasonication dan perawatan 5 menit diizinkan untuk mendapatkan ukuran fragmen DNA yang paling cocok untuk pengujian susunan chip. Akhirnya, prosedur persiapan analit DNA yang terdiri dari 2 menit pertama perawatan ultrasonik, ekstraksi DNA (2 ×), dan selanjutnya sonikasi 5 menit, ditetapkan. (Basselet et al. 2008)


Dari aplikasi diatas dapat disimpulkan bahwa DNA/RNA shearing berbantuan ultrasonic homogenizer dapat terdisruption atau terpotong dengan ukuran 100 - 5kb bp. semakin waktu proses sonikasi bertambah semakin kecil ukuran DNA/RNA yang dipotong. Potongan ukuran DNA/RNA yang diinginkan mempermudah proses penelitian DNA/RNA selanjutnya.

Adapun keuntungan DNA shearing menggunakan Ultrasonic homogenizer addalah

  • control yang tepat
  • siklus sonikasi dan waktu dapat disesuaikan dengan ukuran DNA yang diinginkan
  • fragmen DNA dengan berat molekul tinggi
  • suhu yang dikontrol
  • proses cepat
  • hasil yang dapat direproduksi
  • autoclavable
  • asesoris ultrasonic yang bervariasi Probe-type, VialTweeter dan Cuphorn


Ultrasonic Homogenizer untuk Aplikasi Penelitian Virus Corona

Istilah coronavirus terdiri dari seluruh cabang pohon keluarga virus termasuk patogen penyebab penyakit dalam SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) atau Sindrom Pernapasan Akut Parah dan MERS (Middle Eastern respiratory syndrome) Sindrom Pernapasan Timur Tengah di antara beberapa varian lainnya. Berbicara tentang "coronavirus" merujuk pada jenis virus yang berbahaya dapat dibandingkan dengan mengatakan "mamalia" yang bisa masuk maknanya menjadi "beruang grizzly". Secara teknis itu benar, tetapi sangat tidak spesifik.

Nama koronavirus berasal dari bahasa Latin corona dan bahasa Yunani κορώνη (korṓnē, "lingkaran, untaian"), yang berarti mahkota atau lingkaran cahaya. Namanya mengacu pada penampilan karakteristik virion (bentuk infektif virus) dalam mikroskop elektron, yang memproyeksikan pinggiran permukaan virus yang besar dan bulat yang menghasilkan gambar yang mengingatkan pada mahkota atau korona matahari. Morfologi ini diciptakan oleh peplomer tonjolan protein permukaan virus (S), yang menentukan tropisme inang.

Koronavirus merupakan virus beramplop dengan genom RNA utas tunggal plus dan nukleokapsid berbentuk heliks simetris.Jumlah genom koronavirus berkisar antara 27–34 kilo pasangan basa, terbesar di antara virus RNA yang diketahui.

Protein yang menyusun struktur koronavirus yaitu protein tonjolan (spike) (S), amplop (E), membran (M), dan nukleokapsid (N). Khusus pada virus SARS, letak pengikatan reseptor pada protein S memediasi perlekatan virus ke reseptor sel inangnya yaitu enzim pengubah angiotensin. Beberapa koronavirus (khususnya anggota Betacoronavirus garis keturunan A) juga memiliki tonjolan protein pendek yang disebut Hemaglutinin Esterase (HE).

Dalam aplikasi penelitian virus Corona, ultrasonic homogenizer dapat berperan penting dalam pengaplikasianya yaitu Fragmentasi RNA/Cell Lisis pada jaringan tubuh virus corona. Fragmentasi atau lisis sel adalah bagian umum dari persiapan sampel. Tujuan dari lisis adalah untuk melepaskan bagian dinding sel atau sel lengkap untuk melepaskan molekul biologis. sel lisis adalah proses yang sensitif, karena kemampuan dinding sel untuk menahan tekanan osmotik yang tinggi di dalamnya. Diperlukan kontrol yang baik terhadap fragmentasi sel, untuk menghindari pelepasan semua produk intraseluler tanpa hambatan termasuk puing-puing sel dan asam nukleat, atau denaturasi produk.Gelombang ultrasonik yang menghasilkan kavitasi mendisentegrasi dinding sel dan memfasilitasi pelepasan komponen matriks.

Ultrasonic homogenizer menggunakan prinsip kerja energi kavitasi ultrasonic atau yang disebut dengan kavitasi akustik. Kavitasi merupakan proses pembentukan, pertumbuhan dan hancurnya gelembung vakum dalam cairan akibat adanya gelombang suara (diatas 19Khz) yang akan menghasilkan gelembung cavity.

Gelembung kavitasi tumbuh selama siklus bertekanan tinggi/tekanan rendah yang bergantian, yang masing-masing adalah fase kompresi dan refaction. Setelah tumbuh selama beberapa siklus tekanan bolak-balik, gelembung vakum mencapai titik di mana ia tidak dapat menyerap lebih banyak energi sehingga gelembung meledak dengan keras selama siklus bertekanan tinggi. Selama runtuhnya gelembung, kondisi ekstrim lokal terjadi termasuk suhu ekstrim hingga 5, 000K dengan pemanasan yang sangat tinggi dan tingkat pendinginan yang begitu cepat, tekanan hingga 2000atm dan perbedaan tekanan yang sesuai, dan jet cair dengan kecepatan hingga 280m/s. Dalam hal ini kavitasi “hot-spot” bereaksi ekstrim menciptakan kondisi fisik yang dapat mendisntegrasi sell, memotong ukuran ukuran sel sehingga tercipta kualitas sample yang diinginkan.


Virus ?

Virus adalah partikel infeksius kecil yang membutuhkan sel inang untuk mereplikasi dirinya sendiri. Virus menyerang sel-sel hidup suatu organisme, mulai dari hewan dan tumbuhan hingga mikroorganisme, termasuk bakteri dan archaea.


Struktur Tubuh Virus ?

Secara umum, virus secara signifikan lebih kecil daripada bakteri. Sebagian besar virus yang telah dipelajari hingga saat ini memiliki diameter antara 20 dan 300 nanometer. Karena sebagian besar virus adalah partikel sekecil itu, mikroskop optik tidak memiliki perbesaran yang cukup untuk membuatnya terlihat. Untuk melihat dan mempelajari virus, masing-masing diperlukan pemindaian dan transmisi mikroskop elektron (SEM dan TEM).

Partikel virus lengkap disebut virion. Virion tersebut terdiri dari inti asam nukleat, yang dapat berupa asam ribonukleat atau deoksiribonukleat (RNA atau DNA). Asam nukleat dikelilingi oleh kulit protein luar pelindung yang disebut capsid. Kapsid terbuat dari subunit protein identik yang disebut capsomeres. Inti virion memberikan infektivitas, sementara kapsid memberikan kekhususan pada virus. Prion adalah molekul protein menular yang tidak mengandung DNA atau RNA virus.


Virus Amplop vs Virus Naked ?

Virus yang memiliki amplop lipid dikenal sebagai virus amplop. Amplop yang disebut adalah lapisan lipid yang mengelilingi kapsid protein. Virus mengadopsi amplop dari membran sel inang selama proses tunas. Contoh untuk virus yang diselimuti adalah SARS-CoV-2, HIV, HSV, SARS atau cacar. Virus telanjang/ virus naked tidak memiliki amplop ini karena mereka keluar dari sel dengan melisiskannya. Namun, beberapa virus dapat mengembangkan "kuasi-amplop" yang sepenuhnya menutupi kapsid virus tetapi bebas dari glikoprotein virus. Contoh untuk virus telanjang adalah virus polio, nodavirus, adenovirus, dan SV40.

Elektroforesis Gel ?

Elektroforesis gel adalah metode utama untuk pemisahan dan analisis makromolekul seperti DNA, RNA dan protein serta fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatannya. Ini digunakan dalam kimia klinis untuk memisahkan protein dengan muatan dan / atau ukuran (agarosa IEF, pada dasarnya ukuran independen) dan dalam biokimia, biologi molekuler dan proteomik untuk memisahkan populasi campuran dari fragmen DNA dan RNA, untuk memperkirakan ukuran DNA dan fragmen RNA atau untuk memisahkan protein dengan muatan.



TRIzol ?

TRIzol adalah solusi kimia yang digunakan untuk mengekstraksi RNA / DNA / protein selama ekstraksi guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform. Penggunaan ekstraksi TRIzol yang dibantu secara ultrasonik menghasilkan DNA, RNA, dan protein yang tinggi dari sampel yang sama dan unggul dengan metode ekstraksi lainnya.


Untuk informasi dan pertanyaan seputar produk kami bisa bertanya disini atau menghubungi marketing kami di :

Phone : 021-27899158

Mobile : 0817-0-11-99-22

Chat : WhatsApp

Email : info@petrakaruniapersada.co.id ; admin@petrakaruniapersada.co.id

Marketing kami akan membantu anda